利用實時熒光定量PCR 技術檢測毒素基因快速鑒定A/B型肉毒梭菌方法的建立

黃英 史蕓 葉長蕓 徐雪芳

引用本文: 黃英, 史蕓, 葉長蕓, 徐雪芳. 利用Real-time PCR 技術檢測毒素基因快速鑒定A/B型肉毒梭菌方法的建立[J]. 疾病監測. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.09.015 shu
Citation:  Ying Huang, Yun Shi, Changyun Ye and Xuefang Xu. Establishment of real time PCR assays for rapid detection of Clostridium botulinum type A and B[J]. Disease Surveillance. DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2019.09.015 shu

利用實時熒光定量PCR 技術檢測毒素基因快速鑒定A/B型肉毒梭菌方法的建立

    作者簡介: 黃英,女,北京市人,副主任技師,主要從事病原生物學和形態學研究工作,Email:[email protected];
    通信作者: 徐雪芳, [email protected]
摘要: 目的建立針對A/B型肉毒梭菌毒素基因的實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測方法,構建標準曲線,評價該方法的特異性、敏感性及檢測下限,以提高肉毒梭菌檢測的快速性、準確性。方法根據肉毒梭菌A/B型毒素基因設計特異性引物及探針,優化反應條件,建立real-time PCR反應體系。 用25種細菌評價該方法的特異性,使用含有A/B型毒素基因特異性序列的重組質粒標準品構建標準曲線,模擬糞便標本,評價建立方法的靈敏度。結果建立的real-time PCR檢測方法特異性好,攜帶A/B型毒素基因的重組質粒均出現相應特異性擴增曲線,對其他25種細菌進行試驗擴增時,均未見出現特異性擴增曲線。 根據重組質粒標準品構建的標準曲線可確定其對肉毒梭菌A/B型毒素基因檢測靈敏度分別為5.04×102拷貝/μl和6.91×102拷貝/μl。 模擬糞便標本中含有目的基因重組質粒的檢測下限為A型1.71×103拷貝/μl,B型2.14×103拷貝/μl。結論本研究設計了適合檢測國內肉毒梭菌 A/B 型的引物和探針,建立 real-time?PCR 快速檢測體系,為我國肉毒梭菌 A/B 型菌株的快速鑒定提供一種新的技術手段。

English

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  • 圖 1  毒素A基因重組質粒標準品熒光信號圖(A)及對數值-Ct值對應標準曲線(B)

    Figure 1.  Fluorescent graph and standard curve of type A toxin gene carrying recombinant plasmid amplified in real-time PCR assay

    圖 2  毒素B基因重組質粒標準品熒光信號圖(A)及對數值-Ct值對應標準曲線(B)

    Figure 2.  Fluorescent graph and standard curve of type B toxin gene carrying recombinant plasmid amplified in real-time PCR assay

    表 1  實驗菌株

    Table 1.  Strains used in this study

    序號 菌名 拉丁名 菌株
    1 肉毒梭菌(A、B) Clostridium botulinum 分離菌
    2 艱難梭菌 Clostridium difficile 分離菌
    3 第三梭菌 Clostridium tertium 分離菌
    4 產氣莢膜梭菌 Clostridium perfringens 分離菌
    5 索氏梭菌 Clostridium sordellii 分離菌
    6 蠟樣芽孢桿菌 Bacillus cereus 分離菌
    7 陰溝腸桿菌 Enterobacter cloacae 分離菌
    8 豬鏈球菌 Streptococcus suis 分離菌
    9 小腸結腸耶爾森菌 Yersinia enterocxolitica ATCC23715
    10 糞腸球菌 Enterococcus faecalis ATCC35667
    11 屎腸球菌 Enterococcus faecium 分離菌
    12 單增李斯特菌 Listeria monocytogenes 分離菌
    13 腸出血性大腸埃希菌 Enterohemorrhagic E. coli EDL933
    14 腸致病性大腸埃希菌 Enteropathogenic E. coli 分離菌
    15 腸聚集性大腸埃希菌 Enteroaggregative E. coli 分離菌
    16 腸產毒性大腸埃希菌 Enterotoxigenic E. coli 分離菌
    17 腸侵襲性大腸埃希菌 Enteroinvasive E. coli 分離菌
    18 空腸彎曲 Campylobacter jejuni ATCC33291
    19 霍亂弧菌 Vibrio cholerae 分離菌
    20 傷寒沙門菌 Salmonella typhi H98125
    21 豬霍亂沙門菌 Salmonella choleraesuis ATCC14028
    22 弗勞地枸櫞酸桿菌 Citrobacter freundii 分離菌
    23 阪崎腸桿菌 Enterobacter sakazakii ATCC51329
    24 福氏志賀菌 Shigella flexneri 分離菌
    25 宋內志賀菌 Shigella sonnei ATCC25931
    26 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC6538
    下載: 導出CSV

    表 2  引物和探針序列

    Table 2.  Primers and probes sequences

    擴增基因 引物/探針名稱 堿基序列(5′ ~ 3′) 擴增片段長度(bp)
      A F TAA TAA AAT ATG GGT TAT TCC AGA AAG AG 111
    R TGT TGA ATC ATA ATA TGA AAC TGG AAC T
    P FAM-TCCTGAAGAAGGAGATTTAAATCCACCACCAG-BHQ1
      B F CACAAACATTGCTAGTGTAACTGTTAATAA 130
    R CTATAGTCTCATTTTCATTTAAAACTGGC
    P JOE-CAGTAATCCAGGAGAAGTGGAGCGAAAAAAGG-BHQ2
     注:F.正向引物;R. 反向引物;P. 探針
    下載: 導出CSV
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  • 2018-0434 利用Real-time PCR 技術檢測毒素基因快速鑒定AB型肉毒梭菌方法的建立.docx

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  • 通信作者:  徐雪芳, [email protected]
  • 收稿日期:  2018-10-08
  • 網絡出版日期:  2019-04-23
  • 刊出日期:  2019-09-01
通信作者: 陳斌, [email protected]
  • 1. 

    沈陽化工大學材料科學與工程學院 沈陽 110142

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